SRAP又称为基于序列扩增多态性(Sequence Based Amplified Polymorphism, SBAP)是由美国加州大学蔬菜系Li和Quiros博士于2001年正式提出的一种基于PCR的新型分子标记技术(Li and Quiros, 2001)。该标记采用一对引物对开放阅读框(ORFs)进行扩增，上下游引物分别针对基因外显子中GC含量丰富和启动子、内含子中AT含量丰富的区域进行扩增。因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性(张彤等, 2009)。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、不需预知物种的序列信息的特点，近年来已应用于植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建、目的基因寻找及其定位和比较基因组学研究(Ferriol et ai., 2004; Budak et al., 2004; Li et al., 2003; Fu et al., 2007)，尤其在蔬菜(朱坚等, 2007; 王惠哲等, 2009; 雷剑和柳俊, 2006; 吴红等, 2009)、水果(马明等, 2007; 昝逢刚等, 2009; 曾柏全等, 2008)、农作物(武志朴等, 2005; 吴洁等, 2005; 徐进等, 2008; 秦贺兰等, 2010; 林忠旭等, 2004)以及药用植物(齐树杰等, 2009; 杨向晖等, 2009; 王长林等, 2009; 俞旭平等, 2009, 中草药, 40: 243-245)中得到应用。

国兰，兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)植物，被列为中国十大名花之首。国兰花色素淡，清雅不艳，享有‘天下第一香’的美誉，且具有独特的内涵与意境，具有极高的观赏价值。兰科植物杂交范围很宽，种间，甚至属间亦能杂交；且变异性很大，中间类型多，种的界限不清楚，为兰花品种的研究带来困难。本文应用SRAP技术比较国兰品种间的遗传关系，试图进一步探明其品种鉴定及其分类依据。

1结果与分析
1.1国兰SRAP引物扩增多态性分析
在64对引物组合中(表1)，有57对可以对国兰14样品扩增出较多特异性条带(图1)。57对引物共扩增出746条带，其中有738个多态性位点，总的位点多态性比率为98.9%，平均每对引物组合产生的位点数为13个位点。

表1 研究采用的引物序列及组合 Table 1 Study used a Primer sequences and combinations

图1 引物me7/em7对国兰14样品的SRAP扩增电泳图 注: M: DL2000, maker; 1: 金边墨兰; 2: 墨兰(不是素心); 3: 皇冠蝶; 4: 隆昌素; 5: 叶艺隆昌素; 6: 隆昌素根状茎; 7: 宋梅; 8: 蕙兰; 9: 建兰三星蝶; 10: 龙泉荷; 11: 余蝴蝶; 12: 翠盖荷; 13: 张荷素; 14: 17号 Figure 1 The SRAP amplified band patterns of 14 Chinese Cymbidium samples by the primer pair me7/em7 Note: M: DL2000, maker; 1: Cymbidium sinense with golden edge; 2: Cymbidium sinense; 3: Huangguandie; 4: Longchangsu; 5: Longchangsu with golden edge; 6: Rhizome with Longchangsu; 7: Songmei (L); 8: Huilan; 9: Sanxingdie; 10: Longquanhe; 11: Yuhudie; 12: Cuigai; 13: Zhanghesu; 14: Number 17

1.2国兰品种间相似性分析
采用ntsyspc2.02软件对国兰14样品的SRAP扩增结果进行统计分析，得出其相似性系数矩阵表，见表2。其中，国兰样品间的相似性系数分布在0.625~0.831之间。皇冠蝶与隆昌素试管苗之间的相似性系数最大(0.831)，表明两者之间的遗传距离最近；叶艺隆昌素与龙泉荷之间的相似性系数最小(0.625)，其亲缘关系最远。

表2 供试材料的相似性系数矩阵 Table 2 Similarity coefficients matrix of the tested simples

1.3国兰样品的SRAP聚类分析
利用ntsyspc2.02软件进行数据分析，选用UPGMA法生成聚类分析树状图(图2)。由图可知，蕙兰、春兰、春剑、墨兰、建兰的遗传距离都相距较远。金边墨兰与墨兰在0.803处聚类；春剑里除了叶艺隆昌素外聚为一群；余蝴蝶、翠盖荷及张荷素聚合，龙泉荷和宋梅则是单独一支。

图2 14国兰样品的聚类分析图 注: 1:金边墨兰; 2: 墨兰3: 皇冠蝶; 4: 隆昌素 6: 隆昌素根状茎; 11: 余蝴蝶; 12: 翠盖荷; 13: 张荷素; 9: 建兰三星蝶; 10: 龙泉荷; 14: 17号; 7: 宋梅; 5: 叶艺隆昌素; 8: 蕙兰 Figure 2 The dendrogram of phylogenetic relationship of 14 simples of Chinese Cymbidium Note: 1:Cymbidium sinense with golden edge; 2: Cymbidium sinense; 3: Huangguandie; 4: Longchangsu; 6: Rhizome with Longchangsu; 11: Yuhudie; 12: Cuigai; 13: Zhanghesu; 9: Sanxingdie; 10: Longquanhe; 14: Shiqihao; 7: Songmei(L); 5: Longchangsu with golden edge; 8: Cymbidium faberi “Shengcao”

2讨论
SRAP是新一代基于PCR的分子标记系统，该技术通过独特的双引物设计对基因的ORFs (Open reading frames)的特定区域进行扩增，对基因相对较少的着丝粒和端粒附近区域的扩增较少。SRAP图谱具有多态性高、重复性好、操作简便、引物具有通用性、在基因组中分布均匀等特点，且双向引物可两两搭配组合，降低引物成本，使得SRAP标记更加经济实用。

实验采用13样品进行SRAP分析的聚类结果中，春剑品种中除了叶艺隆昌素聚为一类，叶艺隆昌素是四川省农业科学院园艺研究所培育的隆昌素变异品种，其叶片布满金色丝线，通体黄绿色，目前尚未开花，隆昌素金边的叶片叶绿体如何发生变异的原理尚未了解。春兰中余蝴蝶、翠盖荷、张荷素的亲缘关系较近，向建兰三星蝶、龙泉荷、17号杂交苗和宋梅靠拢。17号杂交苗由两个春兰品种杂交而来，与聚类分析结果吻合。

试验中，选取的实验材料类型包括有激素处理过的试管苗，田间苗，杂交试管苗以及兰花的根状茎。结果表明试管苗、根状茎亦可作为提取植物基因组的材料，这为某些名贵兰花品种的基因提取提供另一途径。实验结果显示，聚类结果与形态学分类基本符合，与花朵特征并未连锁聚类。本研究初步证明利用SRAP 分子标记技术对国兰进行亲缘关系分析的可靠性

3实验材料与方法
3.1供试材料
供试样品14个，包括13个国兰品种和一个国兰品种的根状茎，取至四川省农业科学院园艺所(表3)，取样品新鲜幼嫩叶片2~3片，趁鲜提取DNA。

表3 供试材料及其花朵特征 Table 3 The chinese Cymbidium cultivars and their characteristics of the flowers used in this study

3.2 DNA的提取
取14个样品嫩叶，采用改良后的CTAB法提取样品基因组DNA并检测质量(唐效蓉等, 2006)。

3.3 SRAP反应
反应体系为25 μL，其中模版100 μg，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.3 μmol/L，Mg²⁺ 2 mmol/L，Taq酶1 U，不足部分用ddH₂O补充。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸2 min，44个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用6% PAGE胶分离，上样前用小的注射器反复清洗点样孔。点样后，先用200 V电压预电泳20 min，然后用300 V恒压电泳至二甲苯青条带泳至胶约1/2处，电泳过程中确保胶板温度不高于50℃以免玻璃板破裂。电泳后将清洗后的胶置于硝酸银染色液中染色，再把清洗后的胶放入预冷的显影液中显影，然后拍照、保存。

3.4数据分析
采用Jaccardps相似系数，使用NTSYS软件，非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。相似系数计算公式为：Sij =a/(a+b+c)，其中a表示两份样品共有带数，b表示i样品特有的条带数，c表示j样品特有的条带数。

作者贡献
何俊蓉是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文的修改；蒋彧、刘菲、叶兰香是本研究的实验设计、实验研究的执行人及完成数据分析、论文的撰写；孙淑霞参与实验设计、实验结果分析，王海娥、卓碧萍参与实验设计。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究四川省科技支撑计划(09ZC1745)、“十二五”四川省财政基因工程特色花卉项目、草本花卉新品种选育资助。

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